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分子生物學課件ppt

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分子生物學 第一章 緒論 第一節 分子生物學的定義和研究內容 一、定義 分子生物學是從分子水平研究生命現象及其規律的一門新興、前沿學科。 它以核酸和蛋白質等生物大分子的結構、功能及其在信號傳遞中的作用為研究對象,其發展非常迅速。 分子生物學以其嶄新的觀點和技術向其他學科的全面滲透,推動了許多學科向分子水平發展。 使細胞生物學、遺傳學、發育生物學、神經生物學和生態學由原來的經典學科變成了生命科學的真正前沿科學,形成了一系列交叉學科,如分子遺傳學、分子生態學、分子免疫學、分子病毒學、分子病理學、分子腫瘤學和分子藥理學等。分子生物學是生命科學的核心前沿。 不同種屬生物的表現形式多種多樣和千姿百態,但是,生命活動的本質卻是高度一致的。例如絕大多數生物遺傳取決于DNA;除少數例外,遺傳密碼在整個生命世界中都是一致的。又如核酸一級結構和蛋白質一級結構的對應關系以及蛋白質的有序合成,也表現出高度一致性。 因此,分子生物學開辟了研究各種不同種屬生物的生命現象最基本、最重要的途徑。 分子生物學的發展為人類認識生命現象帶來了前所未有的機遇,也為人類利用和改造生物創造了極為廣闊的前景。 由于生物化學、生物物理學、細胞生物學、遺傳學、應用微生物學及免疫學以及數學、化學、物理學、計算機科學和信息學等專業技術的滲透,分子生物學已發明和創造了一系列新的技術。 例如DNA及RNA的印跡轉移、核酸分子雜交、DNA克隆或重組DNA、基因體外擴增、DNA 測序等等,以及研究蛋白質一級結構、二級結構和三維結構與功能的分析技術。 其中重組DNA(recombinant DNA)技術是現代分子生物學技術的核心。 重組DNA技術又稱為基因操作(gene manipulation )、分子克隆(molecular cloning)、基因克隆(gene cloning) 或基因工程(gene engineering)等。 這些名詞彼此間存在某些微小的差別,在不同情況和不同條件下常常交換使用。 “基因操作”定義為:通過任何方法將細胞外構建的DNA分子(或片段)插入病毒、質?;蚱淥靨逑低?,形成遺傳物質的重新組合,使它們能夠進入宿主細胞內,并能在其中繼續擴增。 而“重組DNA 技術”狹義上具“基因操作”相同的含義,但它涉及范圍更廣泛,甚至泛指分子生物學中與DNA水平研究有關的技術。 因此,分子生物學技術已成為推動生物科學的各個領域向分子水平發展的重要工具或手段,也是服務于人類和社會,推動醫藥和工、農業發展的強大動力。 二、分子生物學的研究內容 分子生物學的研究內容主要包括以下三個方面。 1、核酸分子生物學: 主要研究核酸的結構及其功能。 2、蛋白質分子生物學: 主要研究蛋白質的結構與功能。盡管人類對蛋白質的研究比對核酸研究的歷史要長得多,但由于其研究難度較大,與核酸分子生物學相比發展緩慢。  3. 細胞信號轉導:細胞信號轉導的分子生物學主要研究細胞內、細胞間信息傳遞的分子基礎。 第二節 分子生物學發展簡史 一、生物遺傳物質的發現 早在1868年,Miescher F從膿細胞中分離出細胞核,用稀堿抽提再加入酸,得到了一種含氮和磷特別豐富的物質,當時稱其為核素(nuclein)。1872年,他又在鮭魚精子細胞核中發現了大量的這類物質。由于這類物質都是從細胞核中提取出來的,而且又是酸性,故稱其為核酸(nucleic acid)。 二、現代分子生物學的建立 1950年Astbury WT在一次題為“Adventures in molecular biology”講演中首先使用“分子生物學”這一術語, 用以說明它是研究生物大分子的化學和物理學結構。 1953年Watson JD和Crick FH提出“DNA 雙螺旋結構學說”(生理醫學獎),是分子生物學創建的里程碑。 該學說啟動了分子生物學及重組DNA技術,開創了分子遺傳學基本理論的黃金時代。 其主要進展有: 1953年,Watson和Crick《Nature》雜志上發表一篇震動生物學界的論文“脫氧核糖核酸的結構”。 Watson和Crick的DNA雙螺旋結構學說已被普遍地視為分子生物學發展的最主要里程碑,也是分子生物學及其技術的重要理論基礎。 1956年Kornberg, A.,首先發現DNA聚合酶(生理醫學獎); 1957年,Hoagland MB等分離出tRNA,并對它們在合成蛋白質中轉運氨基酸的功能提出了假設; 1958年,Meselson M及Stahl FW提出了DNA半保留復制模型; 1958年,Weiss SB及Hurwitz J等發現依賴于DNA的RNA聚合酶; 1961年Hall BD等用RNA-DNA雜交證明mRNA與DNA序列互補;這些工作使RNA轉錄合成的機制得以逐步闡明。 1963年,Holley RW 從酵母中提取丙氨酰轉移核糖核酸(tRNA), 1965年,Holley測定了tRNA核苷酸序列(生理醫學獎)。 1968年,Okazaki R(岡崎)等提出了DNA不連續復制模型; 20世紀70年代初獲得DNA拓撲異構酶,并對真核DNA聚合酶特性作了分析研究。這些都逐漸完善了對DNA復制機制的認識。 三、現代分子生物學的深入發展 (一)重組DNA技術的發明 1.基因克隆工具酶的發現: 1970年,Smith HO在微生物中發現一組目前稱之為限制性核酸內切酶的酶類,簡稱限制酶(restriction enzyme)。(生理醫學獎) Temin等從肉瘤病毒(一種逆轉錄病毒)中發現了一種逆轉錄酶(reverse transcriptase)(生理醫學獎) 2.DNA片段的體外連接:1972年,Berg P和Jackson DA等首次將兩個不同生物體來源的DNA片段,在DNA連接酶的作用下進行連接(或重組),產生了第一個重組DNA分子。 3.質粒的構建:1973年,Cohen S 構建了第一個可用于 DNA 分子克隆的載體——質粒(plasmid)。 4.核酸雜交技術:1969年,Pardue ML等首先建立了細胞原位雜交技術。1975 年,Southern EM發明一種印跡雜交技術,被稱為 Southern 印?;騍outhern轉移技術。 5.DNA序列分析技術:1977年,劍橋大學Sanger F等創建了雙脫氧末端終止法測定DNA序列,與此同時,美國Maxam I和Gilbert W發明了化學裂解法或部分降解法測定DNA序列(化學獎)。 6.聚合酶鏈式反應 (polymerase chain reaction,PCR) : 1985年,Mullis K首創聚合酶鏈式反應 (PCR)技術(化學獎)。該技術在體外模擬細胞內DNA的復制過程,進行體外“基因擴增”。 (二) 分子生物學技術的應用與發展 由于分子生物學的廣泛滲透和應用,反過來又推動了重組DNA技術和分子生物學本身的發展。有關這方面的研究進展事例不勝枚舉。現僅就具有重大歷史意義、影響廣泛深遠的主要事件簡述如下。 1.癌基因的發現:1975年,Bishop JM和Vermus HE在Rous肉瘤病毒(一種逆轉錄病毒)中首次發現了第一個癌基因-src。同時證明src基因不是Rous肉瘤病毒所固有、而是來自宿主細胞基因組,在所有小雞細胞中都有其同源副本。 2.基因診斷:1976年,Kan YW應用分子雜交技術,用cDNA探針進行溶液雜交,檢測α-珠蛋白基因有無缺失,首次成功地進行了一例α珠蛋白合成障礙性貧血(又稱為α-地貧)純合子胎兒(胎兒水腫)的產前診斷。這也是首例單基因遺傳疾病的基因診斷。 3.基因組文庫的建立: 1978年,Smithies O等建立了第一個人類基因組文庫(genomic library)。 4.基因工程生產人胰島素: 1979年,Goeddel DV及其同事詳細報道了他們成功地用化學合成的人胰島素基因在大腸桿菌中進行了表達。隨后Eli Lilly公司在1982年獲準銷售基因工程生產的胰島素。 5.轉基因動物: 1981年,Palmiter R和Brinster R利用基因轉移技術成功地建立第一個轉基因小鼠,轉基因動物模型的建立,為研究基因功能及遺傳病的基因治療提供了活體模型。 6. 人類基因治療研究: 1990年4月,美國NIH的Blaese RM和Anderson WF 等首次將腺苷脫氨酶(ADA)基因導入至一位患嚴重復合免疫缺陷癥(SCID)的4歲小孩體內,并取得一定療效,開創了人類基因治療(human gene therapy)的先河,并為20世紀90 年代以來基因治療研究蓬勃開展奠定了基礎。 7.基因工程抗體技術的建立和發展: 人們利用細胞工程技術研制出多種單克隆抗體,為許多疾病的診斷和治療提供了有效的手段。 8.DNA芯片(基因芯片、生物芯片)技術: 是指將大量探針分子固定于固體支持物上,與標記的樣品分子進行雜交,通過檢測每個探針分子的雜交信號強度而獲取樣品分子的數量和序列信息。 (三)基因組研究的進展 基因組(genome)是指一個物種遺傳信息的總和。 2001年2月11日,參加人類基因組計劃的六國科學家、美國塞萊拉遺傳信息公司、美國《科學》雜志和英國《自然》雜志聯合宣布,繼科學家于2000年繪制成功人類基因組工作框架圖之后,又繪制出了更加準確、清晰、完整的人類基因組圖譜,對人類基因組的面貌有了新的發現。 人類基因數量遠比預計的少,人類基因數量僅有2.5~3萬個左右,比以前估計的8萬至10萬個要少得多。 通過進一步研究還發現,男女可能存在巨大遺傳差異,男性染色體減數分裂的突變率是女性的兩倍。并找到了很多與遺傳病有關的基因,包括乳腺癌、遺傳性耳聾、中風、癲癇癥、糖尿病和各種骨骼異常的基因。 (四)基因表達調控機制的研究 1961年,Jacob F和Monod J最早提出操縱子學說(生理醫學),打開了人類認識基因表達調控的窗口。 從80年代開始,人們逐步認識到真核基因的順式調控元件與反式作用因子、核酸與蛋白質間的分子識別與相互作用是真核基因表達調控的根本所在。 1981年,Altman S和 Cech TR同時發現了具有催化自我剪接活性的RNA,稱之為ribozyme(核酶)(化學獎),參與基因表達的調節。 (五)小分子RNA研究進展 1993年,Lee RC等發現線蟲(C.elegans) lin-4基因編碼的小分子RNA,其長度為22~61個核苷酸——反義RNA。 反義RNA能與lin-14 mRNA的3ˊ非翻譯區(untranslated region,UTR)反義互補結合,阻斷lin-14的翻譯,降低線蟲早期發育階段lin-14蛋白的水平。 小干擾性RNA (small interfering RNA,siRNA)系21~25個堿基對的短雙鏈RNA,是長雙鏈RNA (dsRNA)被細胞內Dicer切割而成。 siRNA能誘發細胞內基因沉默,使那些與雙鏈RNA有同源序列的mRNA被降解,從而抑制了該基因的表達,這一現象稱為RNA干擾(RNAi)。 (六)細胞信號轉導機制研究 1957年,Sutherland EW發現了cAMP, 1965年又提出第二信使學說,這是人們認識受體介導的細胞信號轉導的第一個里程碑。 1977年,Ross EM等用重組實驗證實G蛋白的存在和功能,G蛋白參與偶聯信號轉導。 從1957年到2000年從事分子生物學研究的科學家共獲得了31項諾貝爾獎。 第三節 分子生物學與相關學科的關系 一、分子生物學與生物化學 生物化學與分子生物學關系最為密切。兩者在我國教育部和科技部頒布的二級學科中,稱為“生物化學與分子生物學”, 兩者并重。分子生物學雖然主要起源于生物化學,但它又不同于生物化學。 生物化學主要是從化學角度研究生命現象的科學,它著重研究生物體內各種生物分子的化學結構、轉化和新陳代謝。 分子生物學則著重闡明生命物質(核酸與蛋白質)的結構與功能的關系、細胞內信號轉導途經和基因表達調控的機制。 二、細胞生物學與分子生物學 細胞生物學與分子生物學關系十分密切。 傳統上,細胞生物學主要是利用光學顯微鏡和電子顯微鏡研究細胞和亞細胞器的形態、結構與功能。細胞是由許多分子組成的復雜體系,探討組成細胞的生物大分子結構與功能,比單純觀察細胞形態更能深入了解細胞的結構與功能,因此,現代細胞生物學越來越多地應用分子生物學的理論和方法。 分子生物學則是從生物大分子的結構入手,主要研究細胞整體反應的分子機制。這反映了分子生物學和細胞生物學的交叉與融合,因此,產生了細胞分子生物學。 三、分子生物學與遺傳學 遺傳學是研究生物體遺傳和變異的科學。由于分子生物學的興起和發展,現在已經確認生物遺傳信息攜帶者——基因就是DNA分子中的一個片段。 隨著分子生物學向遺傳學深入滲透,經典遺傳學已進入分子水平,因而誕生了分子遺傳學。 分子遺傳學是分子生物學和遺傳學相互交叉和滲透的結果。 分子遺傳學和分子生物學的研究界線越來越模糊,但并不能說分子遺傳學就等于分子生物學, 因為分子生物學研究范圍更廣泛,幾乎包括生命科學各領域的分子水平研究。 四、分子生物學與生物技術 根據美國生物技術產業組織的定義:生物技術(biotechnology)是指“利用細胞和分子過程來解決問題或制造產品的技術”。 現代生物技術主要包括兩個方面:基因(核酸)工程和蛋白質(酶)工程。 這兩方面的生物技術又統稱為分子生物學工程。 練習題(1) 一、名詞解釋 1、基因表達; 2、操縱子 3、反式作用因子; 4、啟動子 5、Southern印跡雜交; 6、轉錄圖 7、生物信息學; 8、轉化 9、α-互補作用 ; 10、鋅指結構 二、選擇題 1、 原核生物基因表達的特點 A 只有一種RNA聚合酶; B 基因以操縱子為基本單位進行表達; C 轉錄和翻譯過程是偶聯進行的; D 轉錄產物需要經過加工修飾。 2、 DNA序列分析的主要應用有 A 分析基因的精細結構; B 用于基因診斷和變異分析; C 由基因結構預測蛋白質功能; D 用于基因工程和蛋白質工程相關分析。 3、 提高表達蛋白的穩定性的措施有 A 讓外源基因和宿主基因一起表達,形成融合蛋白; B 用酶消化載體; C 采用蛋白酶缺陷的突變菌株; D 表達分泌蛋白 三、 問答題 1、簡述PCR定點誘變法的原理與步驟 2、簡述DNA芯片技術的應用 第二章 基 因 與 基 因 組 第一節 基 因 一、基因概念的起源 1865年,現代遺傳學的奠基人Mendel通過著名的豌豆雜交實驗提出遺傳因子學說。 1909年Johannsen將遺傳因子改稱為基因,并提出基因型和表型的概念。 基因型(genotype)是逐代傳遞下去的成對因子的集合,因子中一個來源于父本,另一個來源于母本。 表型(phenotype)是指一些容易區分的個體特征的集合。 二、基因的化學本質 1944年,美國的生物化學家Oswald Avery利用滅活的致病肺炎球菌提取DNA,與非致病肺炎球菌混合培養,使后者轉化為具有致病性的細菌,從而證實遺傳基因的本質是DNA。 1952年,Alfred Hershey和Martha Chase利用病毒證實了DNA是遺傳物質的攜帶者。 三、基因概念的發展與現代理解 Beadle和Tatum在1946年提出了“一個基因一種酶”的理論,并因此獲得1958年的諾貝爾生理學和醫學獎。 但是,對于具有多個亞單位的蛋白質來說,“一個基因一種酶”的假說不夠完善。因此,人們提出了“一個基因,一條多肽鏈”的概念。 然而,在DNA分子中,除了編碼蛋白質的基因外,還有編碼RNA的基因,如編碼tRNA 、rRNA 和snRNA的基因。因此,“一個基因,一條多肽鏈”的理論也不夠完善。 現代基因的定義為: 基因是核酸中貯存遺傳信息的遺傳單位,是貯存有功能的蛋白質多肽鏈或RNA序列信息以及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。 簡單地說, 基因——指導合成有功能的蛋白質多肽鏈或RNA所必需的全部DNA序列。 四、基因的結構 從分子生物學的角度來說,基因是DNA雙螺旋分子中含有特定遺傳信息的一段核苷酸序列。 在基因中用于編碼RNA或蛋白質的DNA序列稱為結構基因(structure gene), 結構基因兩側的側翼序列是不編碼RNA或蛋白質的DNA片段,但含有基因的調控序列(圖2-1)。 圖2-1 基因結構圖 (一) 結構基因 大多數結構基因能通過信使RNA(messenger RNA,mRNA)進一步編碼某種多肽或蛋白質,但有少數結構基因僅僅編碼一些具有特定功能的RNA,如轉運RNA(transfer RNA,tRNA),核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)和其他小分子RNA。 結構基因的DNA雙鏈都有作為模板鏈的可能。 攜帶生物信息(RNA序列信息)的那一條DNA鏈稱為信息鏈或有意義鏈(sense strand)。 由結構基因轉錄所得的RNA分子的核苷酸序列與其信息鏈的核苷酸序列一致,只是以U 取代了T。 5`-ACGTTCCGA-3` 3`-TGCAAGGCT-5` DNA ↓ 5`-ACGUUCCGA-3` RNA 對于編碼蛋白質的基因來說,信息鏈又稱為編碼鏈。 與信息鏈互補的DNA單鏈即為轉錄模板鏈(templates strand) 也稱反意義鏈(antisense strand)??梢雜美春銑梢惶跤肽0錎NA堿基互補的RNA鏈。 原核生物的結構基因是連續的,其RNA合成后不需要經過剪接加工。 大多數真核生物基因則在編碼區(coding region)內含有非編碼的插入序列,因此被稱為斷裂基因(interrupted gene) 斷裂基因——被非編碼序列隔斷了的不連續的結構基因。其中編碼序列稱為外顯子(exon),非編碼序列稱為內含子(intron), 內含子和外顯子一起轉錄,形成mRNA前體(precursor),但是在加工過程中被剪切掉,故內含子不存在于成熟的mRNA序列中。經過剪接,由全部外顯子連接而成的mRNA參與指導多肽鏈的合成。 在真核生物基因的外顯子與內含子接頭處都有一段高度保守的一致序列(consensus sequence)。即內含子5ˊ端大多數是以GT開始,3ˊ端大多數是以AG結束,這稱為GT-AG法則??梢雜盟魑婧嘶蛑蠷NA剪接的識別信號。 (二) 非結構基因 ——參與轉錄調控的順式作用元件 這類調控元件是與結構基因串聯、具有調控轉錄作用的特定DNA序列。由于他們和特定功能的基因連鎖在一起,因此稱為順式作用元件(cis-acting element )。 包括:啟動子、增強子、沉默子、終止子等。 1. 啟動子和上游啟動子元件 (1)啟動子 啟動子(promoter)是指能被RNA聚合酶特異性識別和結合,并能啟動轉錄過程的DNA序列。 啟動子具有方向性,位于結構基因轉錄起始點的上游,本身并不被轉錄。 原核生物基因的啟動子序列具有較高的同源性 。 真核基因啟動子差別很大,但,幾乎所有已發現的真核生物基因的啟動子都有TATA盒(TATA box),其核心序列是TATA(A/T)A(A/T),位于轉錄起始點上游-25 bp左右處,TATA盒與一種被稱為TATA因子(轉錄因子)結合后,成為完整的啟動子,精確地決定RNA合成的起始位點。 啟動子的應用:一個好的啟動子具有重要應用價值。 (2)上游啟動子元件 上游啟動子元件(upstream promoter elements)是TATA盒上游的一些特定的DNA序列。 反式作用因子可與這些元件結合,通過調節TATA因子與TATA盒的結合、RNA 聚合酶與啟動子結合及轉錄起始復合物的形成來調控基因的轉錄效率。 上游啟動子元件包括CAAT盒、CACA盒及GC盒等。 CAAT盒含有5ˊ-GGNCAATCT-3ˊ核心序列。 GC盒含有5ˊ-CCGCC-3ˊ核心序列,兩者位于-70 bp和-120 bp之間,CACA盒的核心序列為GCCACACCC,位于上游-80 bp~-90 bp處。 2.反應元件 一些受體被細胞外信息分子激活后,能與特異的DNA序列結合。被結合的DNA序列能調控基因的表達。這種能介導基因對細胞外的信號產生反應的DNA序列稱為反應元件(response elements)。 能與反應元件結合的信息分子受體叫做反式作用因子,如糖皮質激素受體。 糖皮質激素→~受體(蛋白質)活化+特異的DNA序列(反應元件)→調控基因表達。 反應元件都具有較短的保守序列。 這些元件通常位于啟動子附近和增強子內。 糖皮質激素反應元件在增強子內。 如熱休克反應元件一般在啟動子附近。 3.增強子 增強子(enhancer)是一段能增強鄰近基因轉錄的DNA序列,其中含有多個能被反式作用因子識別與結合的順式作用元件。反式作用因子與這些元件結合后能夠增強鄰近基因的轉錄。 增強子的作用: 主要通過改變DNA模板的螺旋結構、為DNA模板提供特定的局部微環境;或為RNA聚合酶和反式作用因子提供一種結構,以幫助它們與某些順式元件相聯系等方式而發揮調節作用。 增強子在不同的基因中,其位置也不同。 增強子的作用無方向性和基因特異性,也不受基因之間距離遠近的影響。 增強子是一種正調控序列。 增強子的應用: 4、衰減子(沉默子) 1986年Maniatis等研究干擾素-β(IFN-β)基因轉錄時發現了負調控序列。他們把這種對基因轉錄起負調控作用的DNA序列稱為衰減子,或沉默子(silencer)。 在真核細胞中,沉默子對成簇基因的選擇性表達起重要作用。 4.加尾信號 在結構基因的最后一個外顯子中有一個保守的AATAAA序列。這個序列對于mRNA轉錄終止和加poly(A)尾是必不可少的。 AATAAA序列及其下游的一段GT豐富區或T豐富區共同構成poly(A)加尾信號。 poly(A)加尾信號——由AATAAA序列及其下游的一段GT豐富區或T豐富區共同構成的、能終止轉錄和添加多聚A尾的DNA序列。 mRNA轉錄到此部位后,會產生AAUAAA和GU(或U)豐富區。RNA轉錄延長因子可以識別這種結構并與之結合,然后在AAUAAA下游10~30個堿基的部位切斷RNA,并加上poly(A)尾。 第二節 基因組 一個物種的單倍體染色體數目及其所包含的全部遺傳物質,稱為該物種的基因組(genome)。 換句話說,基因組是細胞或生物體中一套完整單倍體所含遺傳物質的總稱。 人類基因組包括核基因組和線粒體基因組。 進化程度越高的生物體其基因組越復雜。 一、病毒基因組的結構和功能 病毒(virus)是一種具有比較原始的生命形態和生命特征的非細胞生物。完整的病毒顆粒包括衣殼蛋白和內部的基因組DNA或RNA, (一)病毒基因組的結構特點 1.不同病毒基因組大小相差較大 與細菌或真核細胞相比,病毒的基因組很小,但是不同的病毒之間其基因組相差甚大。如乙肝病毒(HBV)DNA只有3.2 kb,所含信息量也較小,只能編碼4種蛋白質,而痘病毒的基因組有300 kb之大,可以編碼幾百種蛋白質。 2. 不同病毒的基因組可以是不同結構的核酸 病毒基因組可以由DNA組成,也可以由RNA組成。每種病毒顆粒中只含有一種核酸,DNA或RNA, DNA或RNA可以是單鏈的,也可以是雙鏈的,可以是閉環分子,也可以是線性分子。 3.單倍體基因組 所有病毒基因組都是單倍體,每個基因在病毒顆粒中只出現一次。但逆轉錄病毒基因組例外,它有兩個拷貝(其基因組由兩個相同的線狀正鏈RNA發展組成,稱為二倍體RNA基因組)。 4.病毒基因組有連續的也有不連續的 。 DNA病毒基因組均由連續的DNA分子組成; 多數RNA病毒的基因組是由連續的核糖核酸鏈組成,但有些是由不連續的核糖核酸鏈組成,形成所謂分段基因組(segmented genome)。如流感病毒的基因組有8個節段。 5.基因有連續的和間斷的: 感染細菌的病毒(噬菌體)基因組與細菌基因組結構特征相似,基因是連續的;而感染真核細胞的病毒基因組與真核生物基因組結構特征相似,有的基因具有內含子,基因是間斷的。 有些真核病毒的一部分,對某一個基因來說是內含子,而對另一個基因卻是外顯子。如SV40的早期基因即大T和小t抗原的基因都是從5 146位開始,沿逆時針方向進行,大T抗原基因進行到 2 676位終止,而小t抗原進行到4 624位終止。但是,從4 900到4 555之間有一段346 bp的片段是大T抗原基因的內含子,而該內含子是小t抗原的編碼基因(圖2-2) 。 6.病毒基因組的大部分是用來編碼蛋白質的 病毒基因組的編碼序列大于90%,只有很小的一部分不編碼蛋白質。 7.相關基因叢集 病毒基因組DNA序列中功能上相關的蛋白質的基因或rRNA的基因往往叢集在基因組的一個或幾個特定的部位,形成一個功能單位或轉錄單元。 8.基因重疊 重疊基因(overlapping gene)即同一段DNA片段能夠以兩種或兩種以上的閱讀方式進行閱讀,因而可編碼2種或2種以上多肽。 (二)特殊病毒基因組介紹 1.乙型肝炎病毒: 2.逆轉錄病毒 逆轉錄病毒屬于RNA病毒。所有逆轉錄病毒的共同特點是能夠攜帶或編碼合成逆轉錄酶(RT)。與其它RNA病毒復制不同的是,當病毒感染細胞后,首先以自身的基因組RNA為模板,在RT催化下合成DNA中間體,即前病毒DNA(provirus DNA)。該DNA可以整合到宿主細胞染色體DNA上,并且能夠作為細胞基因組的一部分,隨細胞基因組復制和細胞分裂而傳遞下去;在宿主RNA聚合酶的作用下,原病毒DNA可以重新轉錄形成子代病毒RNA。 二、原核生物基因組 (一)原核生物基因組結構與功能的特點 1.基因組通常僅由一條環狀雙鏈DNA分子組成。 2.基因組中只有1個復制起點。 3.具有操縱子結構。 操縱子(operon)是指數個功能相關的結構基因串聯在一起,構成信息區(多順反子),連同其上游的調控區(包括啟動子和操縱基因)及其下游的轉錄終止信號構成的基因表達單位。 ——由多順反子及其調控序列構成的基因表達單位。 4.結構基因無重疊現象。 5.基因序列是連續的,無內含子結構,轉錄后不需要剪接。 6.編碼區和非編碼區(主要是調控序列)在基因組中約各占50%。 7.基因組多為單拷貝基因,重復基因很少。 8.具有編碼同功酶的基因(isogene)。 9.細菌基因組中存在可移動的DNA序列,包括插入序列和轉座子。 10.在DNA分子中具有多種功能識別區域,如復制起始區、復制終止區、轉錄啟動區和終止區。 (二) 染色體外的遺傳物質——質粒 質粒(plasmid) 是獨立于許多細菌及某些真核細胞(如:酵母等)染色體外的共價閉合環狀DNA分子(cccDNA),是能夠獨立復制的最小遺傳單位。 盡管質粒不是細菌生長、繁殖所必需的物質,但它所攜帶的遺傳信息能賦予細菌特定的遺傳性狀,如耐藥性質粒(R質粒)帶有耐藥基因,可以使宿主菌獲得耐受相應抗生素的能力。 用途: (三)轉座(位)因子 轉座因子(元件)(transposable element) 即可移動的基因成分,是指能夠在一個DNA分子內部或兩個DNA分子之間移動的DNA片段。 細菌的轉位因子(元件)包括插入序列、轉座子及可轉座的噬菌體。 (1)插入序列(insertion sequence,IS) IS是一類較小的沒有表型效應的轉位因子,長度約700~2 000 bp,由一個轉位酶基因及兩側的反向重復序列(inverted repeat sequence,IR)組成。 (2)轉座子(transposon,Tn) Tn是一類較大的可移動成分,除轉座基因外,至少含有一個與轉座無關并決定宿主菌遺傳性狀的其它基因,如抗藥基因。 (3)可轉座的噬菌體(transposable phage) 是一類具轉座功能的溶源性噬菌體,包括Mu和D108等。 Mu噬菌體是大腸桿菌的一種溫和致突變噬菌體,是原核生物中第一個被闡明的可移動因子。 噬菌體感染細菌后,通過整合作用,可插入細菌結構基因內,引起突變。 2. 轉位作用的機理 3. 轉位的遺傳效應 (1)轉位因子插入到結構基因中可使基因序列發生改變,造成基因插入失活或功能改變;如果插入到非編碼區(調控區),可使下游基因不能轉錄;轉位因子的插入還可能引起基因突變、缺失和基因重排。 (2)由于轉位因子的縱向轉位插入,可產生新基因,如R質粒的轉位因子轉位到染色體上,在該部位出現抗藥性基因,從而使抗藥性在菌群中得以傳播; 練習題(2) 名詞解釋 1、 基因表達調控 2、多順反子 3、DNA多態性 4、增強子 5、PCR 6、基因組作圖 7、蛋白質工程 8、轉導 9、 cDNA文庫 10、 DNA指紋圖譜 二、選擇題 1、真核生物基因表達的特點有( ) A 基因表達具有時間性和空間性; B 轉錄和翻譯過程分開進行; C 初級轉錄產物要經過加工修飾; D 也有超基因式操縱子結構。 2、 提高PCR擴增的特異性的途徑和方法有( ) A 提高退火溫度、縮短退火和延伸時間; B 增加dNTP濃度 C 降低引物和酶的濃度; D 提高引物設計的特異性。 3、引物設計原則有( ) A 特異引物長度控制在20~30 bp; B G + C含量控制在40-60%; C 引物自身和引物之間沒有互補序列; D 引物3′不能進行任何修飾。 三、問答題 簡述基因克隆的主要步驟 簡述藍-白篩選的原理與方法 四、 計算題 現有OD260為0.5,堿基數為25的干粉DNA引物。請將它配制成濃度為10 pmol / µl的應用液。如果50 µl PCR反應體系需要40 pmol 引物,請問25 µl 反應體系需要這種濃度的應用液多少微升?

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